Los investigadores están subestimando sustancialmente los errores de edición de genes, concluye un nuevo artículo

por Jonathan Latham, PhD

Febrero 25 de 2020

La herramienta estándar de edición de genes, CRISPR-Cas9, con frecuencia produce un tipo de mutación de ADN que el análisis genético común no detecta, afirma una nueva investigación publicada en la revista Science Advances. Al describir estos hallazgos, los investigadores llamaron a tales descuidos "serios errores" de la edición de genes (Skryabin et al., 2020). En general, los nuevos resultados sugieren que la edición de genes es más propensa a errores de lo que se pensaba y, además, que identificar y descartar resultados defectuosos y no deseados no es tan fácil como generalmente se supone.

Derivado originalmente de la bacteria Streptococcus pyogenes, CRISPR-Cas9 es un sistema de corte y selección de ADN. CRISPR significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas agrupadas y se refiere a la molécula de ARN que es el componente de direccionamiento del sistema. Este ARN CRISPR a veces también se conoce como el ARN guía. El componente Cas9 es una nucleasa, es decir, una enzima que corta el ADN. Por lo tanto, en el proceso de edición, la enzima Cas9 es guiada al sitio de corte previsto por el ARN CRISPR. La asamblea completa a menudo se llama CRISPR.

Existen otros métodos de edición de genes (por ejemplo, Zn Finger, TALEN). Sin embargo, debido a la flexibilidad de su mecanismo de selección de ARN, CRISPR, en particular, ha sido objeto de una gran emoción en los sectores de biotecnología e investigación agrícola.

CRISPR se ha utilizado principalmente para crear mutaciones genéticas o para insertar ADN extraño en las ubicaciones deseadas en un genoma. Sin embargo, otras aplicaciones, como las unidades de genes, también han sido discutidas. A pesar de la emoción, como ha resumido Friends of the Earth, solo se puede encontrar un pequeño puñado de productos comerciales editados con genes en el mercado.

Sin embargo, para muchos usos, la edición de genes con CRISPR es insuficientemente precisa y una gran cantidad de investigación se orienta actualmente a solucionar este defecto.

Gran parte de la falta de precisión de CRISPR deriva del hecho de que, aunque se llama "edición", CRISPR y las técnicas relacionadas son enzimas de corte solamente. No tienen función de reparación de ADN. Esto significa que cuando se realizan reparaciones en el ADN en el sitio de corte (y el corte debe repararse para que la célula sobreviva), están en gran medida fuera del control del experimentador. Por lo tanto, diez eventos de edición independientes darán diez mutaciones diferentes en la misma ubicación en el genoma.

Por lo tanto, a un nivel muy básico, es probable que cada mutación creada en el sitio objetivo sea única. Incluso en la medida, como informamos, que el ADN de otras especies puede terminar siendo incorporado inesperadamente en el genoma editado.

Para agregar a esta incertidumbre, diferentes ubicaciones del genoma, diferentes tipos de células, diferentes especies y diferentes versiones de CRISPR, pueden influir en los tipos de alteración genética que se encuentran en el sitio objetivo.

En algunas aplicaciones, principalmente investigación básica, la falta de precisión de este tipo no es necesariamente un problema importante. En la mejora de cultivos, por ejemplo, las células u organismos que contienen alteraciones indeseables o mutaciones fuera del objetivo pueden, en teoría, detectarse y descartarse.

Pero en muchas aplicaciones, principalmente en medicina y productos comerciales, solo se acepta una precisión más o menos completa, por razones de seguridad. La edición inexacta de las células humanas en una prueba temprana de terapia génica una vez dio como resultado que 2 de 11 niños tratados desarrollaran leucemia debido a efectos fuera del objetivo y llevó a que la prueba se cerrara.

La cuestión de si los investigadores y / o desarrolladores de organismos editados podrían detectar o descartar adecuadamente o descartar mutaciones indeseables es una preocupación real. Recombinetics es una empresa comercial que, en 2016, creó una vaca sin cuernos que, según afirma, fue el resultado previsto de una edición genética precisa. Pero los investigadores de la FDA que examinaron los datos de la secuencia de ADN de la compañía pudieron demostrar que los dos terneros editados independientemente contenían, en el sitio de la edición, genes completos de resistencia a los antibióticos (Norris et al., 2020).

Cuando la FDA pudo demostrar esto, sin embargo, la descendencia de los terneros ya estaba incorporada en un programa de cría brasileño. Este programa de reproducción ahora ha sido abandonado.

La nueva investigación de PNAS, publicada el 12 de febrero, aborda directamente si los investigadores CRISPR pueden, de hecho, detectar ediciones aberrantes.

Los investigadores alemanes y chinos editaron los ovocitos de ratón (es decir, embriones) con el paso adicional (en comparación con el simple corte) de agregar un tramo de ADN (el ADN del donante) que esperaban que se integrara en el sitio de corte.

Sin embargo, lo que encontraron inesperadamente es que, en una alta proporción de sitios objetivo, ocurrieron inserciones complejas del ADN deseado. En lugar de simplemente integrar copias individuales del ADN del donante en el sitio de corte, las integraciones de ADN eran comúnmente arreglos de varias copias de cabeza a cola. Como dice el documento:

"En general, concluimos que la integración repetitiva de la cabeza a la cola de la plantilla de ADN del donante es un subproducto común del proceso de edición del genoma basado en HDR mediado por CRISPR-Cas9, independientemente del tamaño de la plantilla de ADN del donante, la composición de la secuencia, o varada de la plantilla (dsDNA o ssDNA) ". [nota del editor: ds = doble cadena; ss = monocatenario]

Por "común", los investigadores querían decir que, en un experimento, entre 34 ratones editados, seis contenían inserciones de la cabeza a la cola. En otros experimentos, 30 de 49 ratones contenían inserciones de la cabeza a la cola.

En otras palabras, las inserciones complejas y aberrantes de ADN fueron hallazgos comunes. Es importante destacar que ocurrieron en múltiples experimentos, lo que significa que esto parece ser cierto independientemente de en qué ADN se insertó o en qué tramo del genoma se insertó. Esto en sí mismo es un hallazgo muy significativo.

Aún más notable, sin embargo, fue que estos reordenamientos genéticos complejos rara vez se detectaron mediante métodos analíticos estándar. Los autores calificaron este hallazgo de "perturbador".

Ellos escribieron:

"El análisis de PCR aplicado convencionalmente, en la mayoría de los casos, no pudo identificar estos eventos de integración múltiple, lo que condujo a una alta tasa de alelos editados con precisión y falsos".

Sin ser detectados, tales eventos aberrantes "minarían la validez de los estudios" según los autores.

En entornos experimentales esto es indudablemente cierto. Pero para el público en general existe una implicación más importante. Con compañías y biohackers con la esperanza de llevar al mercado productos editados con genoma rápidamente (y sin escrutinio regulatorio), esta investigación representa una importante historia de advertencia; especialmente porque los autores especulan que sus resultados probablemente se apliquen igualmente a otros métodos de edición, como TALEN y nucleasas Zn Finger.

Referencias

Boris V. Skryabin, Delf-Magnus Kummerfeld, Leonid Gubar, Birte Seeger, Helena Kaiser et al. (2020) Las inserciones generalizadas de cabeza a cola de las plantillas de ADN enmascaran los eventos de edición del genoma mediados por CRISPR-Cas9 deseados. Avances científicos 6 eaax2941 DOI: 10.1126 / sciadv.aax2941

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Fuente:

https://www.independentsciencenews.org/news/researchers-are-substantially-undercounting-editing-errors/

Traducción: Google